Secuenciación

La secuenciación es el método mediante el cual podemos determinar la secuencia de nucleótidos que conforma los fragmentos de ADN

Método Sanger 

El Método de Sanger se diseño en el año de 1977 por el mismo Fred Sanger, tambien conocido  como método didesoxi o secuenciación por terminación de la cadena. Es un método enzimático que permite conocer la secuencia del molde a medida que se sintetiza su hebra complementaria y para llevarse a cabo los siguientes componentes 

• Un ADN de cadena sencilla
• un cebador para iniciar la síntesis de ADN
• los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfato (dATP, dGTP, dCTP y dTTP) 
• los cuatro didesoxiribonucleótidos trifosfato (ddATP, ddGTP, ddCTP y ddTTP) que son utilizados por la ADN polimerasa para construir la nueva hebra pero, una vez incorporados, impiden la adición de nuevos nucleótidos.

La secuenciación se lleva a cabo en cuatro tubos donde se agregan los componentes anteriormente mencionados a excepción de los ddNTP donde se agrega uno diferente en cada tubo.

En os tubos la ADN polimerasa incorpora de manera aleatoria un ddNTP la reacción se dentiene, de está forma se generan fragmentos de distinta longitud, todos ellos con el mismo ddNTP.

Estructura quimica de los nucleótidos didesoxi (ddNTP) y los desoxi (dNTP)
  

En la actualidad se ha conseguido por medio de variaciones en el método original de Sanger automatizar el proceso.
Estas mejoras incluyen los ddNTp marcados fluorescentemente. Cada ddNTP se marca con un fluoróforo diferente, ninguno interviene en la reacción de la polimerasa emitiendo luz con una longitud de onda característica, proceso que se lleva a cabo en un sólo tubo, no en cuatro.
También  se sustuyo la ADN polimerasa por la Taq-Polimerasa. asi fue posible realizar el proceso de manera automática como si se tratara de la técnica PCR así en cada ciclo aumenta en numero de fragmentos de manera exponencial los cuales están marcados con una molecula fluorescente por lo cual se le conoce como secuenciación cíclica.

Aminoácidos ( Unidades estructurales de las proteínas)

Las proteínas son polímeros formados de monómeros de aminoácidos los cuales les confieren  propiedades únicas, de modo que se pueden entender analizando las propiedades químicas de los aminoácidos que las constituyen.

En las proteínas se encuentran casi siempre 20 aminoácidos.

Estructura de los aminoácidos 

Todos los aminoácidos poseen un grupo amino y uno carboxilo separados entre sí por un carbono.

Durante el proceso de síntesis de proteína cada aminoácido se une a otros dos y forma un polímero largo ramificado llamado cadena polipeptídica 

Estructura base, de los aminoácidos 

grupo amino y carboxilo.

Clasificación de los aminoácidos 

Los aminoácidos se clasifican de acuerdo con la naturaleza de sus cadenas laterales 

• Cadenas polares cargadas: Ácido aspartico, Ácido glutámico, Lisina, Arginina e Histidina
• Cadenas polares no cargadas: serina, Treonina,Glutamina, Asparagina, Tirosina
• Cadenas no polares: Alanina, valina, Leucina, Isoleucina, Metionina, Fenilalanina, Triptófano.
• Propiedades únicas: Glicina, Cisteína,Prolina.

Propiedades de las cadenas laterales (R)

las cadenas laterales hidrófilas actúan como ácidos o bases que tienden a estar cargados por completo (+ o-)

Propiedades de la cadena lateral:

 en aminoacidos no polares: la cadena lateral hidrófoba consiste casi por completo en átomos de H y C. Estos aminoácidos tienen a formar el centro de las proteínas solubles y se concentran lejos del medio acuoso. Dichos aminoácidos juegan un papel importante en las membranas ya que se vinculan con la bicapa lipídica.

Propiedades de la cadena lateral: 
las cadenas laterales hidrófilas tienden a tener cargas en parte + o - que les permiten participar en reacciones químicas, formando puentes de hidrogeno y relacionarse con el agua

Glicina: la cadena lateral está constituida sólo por un átomo de hidrógeno y puede incluirse en un ambiente hidrófilo o hidrófobo. La glicina reside a menudo en sitios donde los dos polipéptidos entran en contacto estrecho.

Cisteína: aunque la cadena lateral tiene una naturaleza polar sin carga, posee la propiedad única de formar enlaces covalentes con otra cisteína para formar un enlace disulfuro.

Prolina: aunque la cadena lateral tiene una naturaleza hidrófoba, posee la propiedad única de crear enrollamientos en las cadenas polipeptídicas y romper estructuras secundarias ordenadas.

Electroforesis

La electroforesis es una técnica que nos permite separar las moléculas según su carga eléctrica y tamaño, a través de una matriz porosa que separa los  fragmentos de ADN. Se empleo por primera vez en el año 1937 por Tiselius y a lo largo de los años ha ido perfeccionándose, de modo que en la actualidad se ha vuelto casi imprescindible.

Fundamentos

La electroforesis se basa en la migración de las moléculas según su carga (- y +), las  biomacromoléculas (proteínas, ácidos nucleicos y polisacáridos) poseen determinada carga eléctrica con grupos aniónicos y catiónicos capaces de disociarse.
El sistema de electroforesis a emplear se decide en función de los objetivos que se desean lograr  algunos de mas empleados son ,  gel uniforme y tampón homogéneo, y gel y tampón heterogéneo.
La velocidad con la que las moléculas migran va depender de su densidad, voltaje aplicado y porosidad del gel de electroforesis.

La separación electroforetica de proteínas casi siempre se realiza por electroforesis en gel de poliacrilamia (PAGE), donde las proteínas son impulsadas a través de una matriz gelatinosa.
Esta matriz está compuesta de pequeño polímeros de una molécula orgánica ( acrilamida) la cual establece enlaces cruzados formando un tamiz o red.
El gel de poliacrilamida puede formarse como una losa delgada entre dos placas de vidrio.
Una vez que el gel se polimeriza, se suspende entre dos comportamientos los cuales contienen un amortiguador en el que se sumergen electrodos opuestos.
En los geles que tiene forma de losa, la muestra que contiene la proteínas de nuestro interés son colocadas en ranuras  sobre el borde superior del gel.
 Posteriormente se aplica el voltaje y la corriente fluye por la losa de gel lo que hace que las proteínas se muevan hacia el electrodo de carga opuesta.
Después de la electroforesis, la losa se retira de las placas  y se tiñe.

Electroforesis en gel de poliacrilamida
Las muestras de proteína suelen disolverse en una solución de sacarosa cuya densidad impide que la muestra se mezcle con el amortiguador y luego se carga en los pozos con una pipeta fina (paso 1).
Después se aplica la corriente directa al ge, lo que ocasiona que las proteínas se muevan en la poliacrilamida en carriles paralelos, las proteínas se mueven como bandas inversamente proporcionales a su masa molecular. (paso 2)
una vez que la electroforesis se completa, el gel se retira del marco de vidrio y se tiñe en una charola (paso 3)













Bibliografía

Hilda, Dra, and Marilín García. 2000. “Electroforesis En Geles de Poliacrilamida : Fundamentos , Actualidad e Importancia.” 1(2): 31–41.

Ill, S I S, and Morales Becerril. “Fundamentos y Conceptos Básicos.

Da clic aquí para ver un vídeo relacionado con la electroforesis

Técnica de PCR

PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) como herramienta de diagnostico de enfermedades en cultivos acuícolas.

Debido a que en las ultimas décadas las enfermedades por presencia de patógenos en los cultivos acuícolas  han ocasionado grandes perdidas económicas a lo largo de la historia, ha sido necesario desarrollar y perfeccionar técnicas que nos permitan detectar los agentes causales de dichas enfermedades.

La  PCR destaca por ser una de las técnicas que permiten un diagnostico rápido y confiable de dichos patógenos, para poder prevenir y/o dar un tratamiento oportuno la cual permite amplificar pequeños segmentos de ADN para identificar organismos microscópicos  que causan enfermedades.

Principios de la técnica PCR

La PCR permite amplificar de manera selectiva fragmentos de ADN de un determinado organismo, fragmento que se encuentra entre dos regiones cuya secuencias debe ser conocidas, estas regiones actúan como iniciadores de la reacción de síntesis del ADN la cual está catalizada por la enzima ADN polimerasa.

La reacción consta de varias ciclos que se llegan a cabo de manera sucesiva, los cuales se caracterizan por incluir tres fases

• Desnaturalización
• Hibridación
• Elongación

Como resultado de la serie de ciclos se obtiene la amplificación exponencial del fragmento de interés.

Bibliografía:
Gibello A, Del Mar Blanco, Dominguez L, Fernande G. J. F. Utilización de la PCR para el diagnostico en Ictiopatología. Universidad Complutense de Madrid. Madrid, España.

Extracción de ADN

La aplicación de diferentes técnicas moleculares para el estudio del genoma de los organismos, depende en gran parte de la calidad y cantidad disponible de ADN.

Hacer uso apropiado de métodos viables para la extracción del ADN es un punto critico para poder llevar a cabo los objetivos de nuestra investigación.

En peces, las aletas, sangre, musculo, escamas y óvulos suelen ser puntos de interés para la extracción de ADN donde el uso del protocolo de extracción fenol-cloroformo ha sido el método mas usado para la extracción de ADN en peces.