Secuenciación

La secuenciación es el método mediante el cual podemos determinar la secuencia de nucleótidos que conforma los fragmentos de ADN

Método Sanger 

El Método de Sanger se diseño en el año de 1977 por el mismo Fred Sanger, tambien conocido  como método didesoxi o secuenciación por terminación de la cadena. Es un método enzimático que permite conocer la secuencia del molde a medida que se sintetiza su hebra complementaria y para llevarse a cabo los siguientes componentes 

• Un ADN de cadena sencilla
• un cebador para iniciar la síntesis de ADN
• los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfato (dATP, dGTP, dCTP y dTTP) 
• los cuatro didesoxiribonucleótidos trifosfato (ddATP, ddGTP, ddCTP y ddTTP) que son utilizados por la ADN polimerasa para construir la nueva hebra pero, una vez incorporados, impiden la adición de nuevos nucleótidos.

La secuenciación se lleva a cabo en cuatro tubos donde se agregan los componentes anteriormente mencionados a excepción de los ddNTP donde se agrega uno diferente en cada tubo.

En os tubos la ADN polimerasa incorpora de manera aleatoria un ddNTP la reacción se dentiene, de está forma se generan fragmentos de distinta longitud, todos ellos con el mismo ddNTP.

Estructura quimica de los nucleótidos didesoxi (ddNTP) y los desoxi (dNTP)
  

En la actualidad se ha conseguido por medio de variaciones en el método original de Sanger automatizar el proceso.
Estas mejoras incluyen los ddNTp marcados fluorescentemente. Cada ddNTP se marca con un fluoróforo diferente, ninguno interviene en la reacción de la polimerasa emitiendo luz con una longitud de onda característica, proceso que se lleva a cabo en un sólo tubo, no en cuatro.
También  se sustuyo la ADN polimerasa por la Taq-Polimerasa. asi fue posible realizar el proceso de manera automática como si se tratara de la técnica PCR así en cada ciclo aumenta en numero de fragmentos de manera exponencial los cuales están marcados con una molecula fluorescente por lo cual se le conoce como secuenciación cíclica.